革蘭氏染色

一、目的：在細胞發(fā)放之前,利用標準的革蘭氏染色法對即將發(fā)放的細胞懸液進(jìn)行檢測,判斷細胞懸液中是否含有革蘭氏陽(yáng)性菌或革蘭氏陰性菌.

二、原理：

通過(guò)結晶紫初染和碘液媒染后,在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物,革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密,故遇乙醇脫色處理時(shí),因失水反而使網(wǎng)孔縮小,再加上它不含類(lèi)脂,故乙醇處理不會(huì )出現縫隙,因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內,使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類(lèi)脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差,在遇脫色劑后,以類(lèi)脂為主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出,因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色,再經(jīng)沙黃等紅色染料復染,就使革蘭氏陰性菌呈紅色.

三、實(shí)驗用品準備：

滅菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul滅菌移液吸頭、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸頭、接種環(huán)、酒精燈、打火機、革蘭氏染色液、吸水紙、顯微鏡、香柏油、擦鏡紙、計時(shí)器

四、操作：

1 涂片：取滅過(guò)菌的載玻片于實(shí)驗臺上,用移液槍吸取10ul待檢樣品滴在載玻片的中央,用燒紅冷卻后的接種環(huán)將液滴涂布成一均勻的薄層,涂布面不宜過(guò)大.

2 干燥：將標本面向上,手持載玻片一端的兩側,小心地在酒精燈上高處微微加熱,使水分蒸發(fā),但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過(guò)長(cháng),以防標本烤枯而變形.

3 固定：固定常常利用高溫,手持載玻片的一端,標本向上,在酒精燈火焰處盡快的來(lái)回通過(guò)2-3次,共約2-3秒種,并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚,不覺(jué)過(guò)燙為宜（不超過(guò)60℃）,放置待冷后,進(jìn)行染色.

4 初染：在涂片薄膜上滴加草酸銨結晶紫1-2滴,使染色液覆蓋涂片,染色約1min.

5 水洗：斜置載玻片,在自來(lái)水龍頭下用小股水流沖洗,直至洗下的水呈無(wú)色為止.

6 媒染：用100-1000ul移液槍吸取約300ul碘液滴在涂片薄膜上,使染色液覆蓋涂片,染色約1min.

7 水洗：斜置載玻片,在自來(lái)水龍頭下用小股水流沖洗,直至洗下的水呈無(wú)色為止.

8 脫色：斜置載玻片,滴加95%乙醇脫色,至流出的乙醇不現紫色為止,大約需時(shí)20-30S,隨即水洗.

9 復染：在涂片薄膜上滴加沙黃染液1-2滴,使染色液覆蓋涂片,染色約1min.

10 水洗：斜置載玻片,在自來(lái)水龍頭下用小股水流沖洗,直至洗下的水呈無(wú)色為止.

11 干燥、觀(guān)察：用吸水紙吸掉水滴,待標本片干后置顯微鏡下,用低倍鏡觀(guān)察,發(fā)現目的物后滴一滴浸油在玻片上,用油鏡觀(guān)察細菌的形態(tài)及顏色,紫色的是革蘭氏陽(yáng)性菌,紅色的是革蘭氏陰性菌