一、微生物定性替代檢驗方法的驗證

專(zhuān)屬性：

微生物定性檢驗的專(zhuān)屬性是指檢測樣品中可能存在的特定微生物種類(lèi)的能力。當替代方法以微生物生長(cháng)作為判斷微生物是否存在時(shí)，其專(zhuān)屬性驗證時(shí)應確認所用培養基的促生長(cháng)試驗，還應考慮樣品的存在對檢驗結果的影響。當替代方法不是以微生物生長(cháng)作為判斷指標時(shí)，其專(zhuān)屬性驗證應確認檢測系統中的外來(lái)成分不得干擾試驗而影響結果，如確認樣品的存在不會(huì )對檢驗結果造成影響。采用替代方法進(jìn)行控制菌的檢驗，還應選擇與控制菌具有類(lèi)似特性的菌株作為驗證對象。

檢測限：

微生物定性檢驗的檢測限是指在替代方法設定的檢驗條件下，樣品中能被檢出的微生物的最低數量。由于微生物所具有的特殊性質(zhì)，檢測限是指在稀釋或培養之前初始樣品所含有的微生物數量，而不是指檢驗過(guò)程中某一環(huán)節的供試液中所含有的微生物數量。

檢測限確定的方法是在樣品中接種較低濃度的試驗菌(每單位不超過(guò)5cfu)，然后分別采用藥典方法和替代方法對該試驗菌進(jìn)行檢驗，以檢出與否來(lái)比較兩種方法的差異。試驗菌接種量須根據試驗而定，以接種后采用藥典方法50%的樣品可檢出該試驗菌為宜。檢測限驗證至少應重復進(jìn)行5次。對于同一種試驗菌可釆用卡方檢驗來(lái)評價(jià)兩種方法的檢測限是否存在差異。

重現性:

重現性可視為微生物檢驗方法在檢驗結果上抵抗操作和環(huán)境變化的能力。方法使用者應優(yōu)先測定該驗證參數。在樣品中接種一定數量的試驗菌（接種量應在檢測限以上），采用藥典方法和替代方法，分別由不同人員，在不同時(shí)間，使用不同的試劑（或儀器）進(jìn)行檢，采用卡方檢驗(f)來(lái)評價(jià)兩種方法的重現性是否存在異。驗證過(guò)程中，應關(guān)注樣品的一致性。

耐用性:

與藥典方法比較，若替代方法檢驗條件較為苛刻，則應在方法中加以說(shuō)明。替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必須的，但應單獨對替代方法的耐用性進(jìn)行評價(jià)，以便了解方法的關(guān)鍵操作點(diǎn)。

二、樣品中微生物定量檢驗方法的驗證

準確度：

微生物定量檢驗的準確度是指替代方法的檢驗結果與藥典方法檢驗結果一致的程度，通常用微生物的回收率（％)來(lái)表示。準確度驗證的方法：制備試驗菌的菌懸液，菌懸液的濃度應選擇為能夠準確計數的最高濃度，然后系列稀釋至較低濃度（如小于10cfu/ml)。例如，菌落計數平皿法的替代方法，在制備髙濃度菌懸液時(shí)其濃度是103cfu/ml，系列稀釋至100cfu/ml。每個(gè)試驗菌應至少選擇5個(gè)菌濃度進(jìn)行準確度確認，替代方法的檢驗結果不得少于藥典方法檢驗結果70% ，也可以采用合適的統計學(xué)方法表明替代方法的回收率至少與藥典方法一致。當替代方法的回收率高于藥典方法時(shí)，有必要結合專(zhuān)屬無(wú)菌檢查方法適用性。

精密度:

精密度驗證的方法是：制備試驗菌的菌懸液，齒懸液的濃度應選擇為能夠準確讀數的最高濃度，然后系列稀釋至較低濃度（如小于10cfu/ml)。每個(gè)試驗菌選擇其中至少5個(gè)濃度的菌懸液進(jìn)行檢驗。每一個(gè)濃度至少應進(jìn)行10次重復檢驗，以便能夠采用統計分析方法得到標準偏差或相對標準偏差。

專(zhuān)屬性：

專(zhuān)屬性驗證應證明當樣品中存在一定數量的試驗菌時(shí)，通過(guò)平皿法檢驗，能夠檢出試驗菌，而樣品的存在不會(huì )對結果造成影響。專(zhuān)屬性驗證時(shí)，應能夠設計出可能使替代方法出現假陽(yáng)性的實(shí)驗模型來(lái)挑戰替代方法。當替代方法不依賴(lài)微生物生長(cháng)出菌落或出現混濁就可以定量時(shí)(如不需要增菌或在1?50cfu范圍內就可直接測定菌數的定量方法），以上驗證方式就顯得更為重要。

定量限：

定量限驗證的方法是：在檢驗范圍的低限制備5份不同含菌濃度的菌懸液，每份菌懸液分別用藥典方法和替代方法進(jìn)行不少于5次檢驗，采用統計方法比較替代方法的檢驗結果與藥典方法結果的差異，從而評價(jià)替代方法的定量限。

線(xiàn)性和范圍：

線(xiàn)性驗證時(shí)必須覆蓋能夠準確測定的所有濃度范圍。每株試驗菌應選擇至少5個(gè)濃度，每個(gè)濃度至少測定5次。根據以上實(shí)驗數據，以檢驗結果為因變量，以樣品中微生物的預期數量為自變量進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，計算相關(guān)系數r。替代方法的相關(guān)系數不得低于0.95。微生物定量檢驗的范圍是指能夠達到一定的準確度、精密度和線(xiàn)性，檢驗方法適用的髙低限濃度或數量的區間。

重現性:

在樣品中接種一定數量的試驗菌（接種量應在定量限以上），采用藥典方法和替代方法，分別由不同人員，在不同時(shí)間，使用不同的試劑（或儀器）進(jìn)行檢驗，對檢驗結果進(jìn)行統計分析，以相對標準偏差（RSD) 來(lái)評價(jià)兩種方法的重現性差異。

耐用性:

替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必須的，但應單獨對替代方法的耐用性進(jìn)行評價(jià)，以便了解方法的關(guān)鍵操作點(diǎn)。